弓形虫病是由专性细胞内原生动物寄生虫刚地弓形虫(弓形虫)引起的一种普遍存在于世界各地的传染病。在目前的研究中介绍了治疗弓形虫的有前途的新化合物。为了检测其体外抗弓形虫速殖子的效力，制备了6个末端含有NH2或OH基团的1,2,3-三唑基磺酰胺支架，并对其作为磺胺嘧啶的等效物进行了研究。与阳性对照磺胺嘧啶相比，杂交分子显示出更强的抗弓形虫活性。结果表明，化合物3(a-f)的IC50分别为0.07492 μM、0.07455 μM、0.0392 μM、0.03124 μM、0.0533 μM和0.01835 μM，磺胺嘧啶的IC50分别为0.1852 μM。所研究的1,2,3-三唑-磺胺类药物分子偶联物3(a-f)的选择性指数分别为10.4、8.9、25.4、21、8.3和29;分别。目前的研究重点是新合成的氨基衍生物3(d-f)，因为它们含有更有效的氨基酸，被认为是必需元素，并促进更好的生物活性。通过扫描电镜观察，细胞外速殖子在处理2小时后发生了显著的形态变化。此外，细胞内速殖子暴露于新合成的氨基衍生物3(d-f)处理24小时后，透射电子显微镜(TEM)显示细胞病变作用的损伤和形态学改变。其中化合物3f的变化最为明显，表明其对弓形虫的抗虫活性最强。
几乎所有温血动物都容易感染被称为弓形虫(T. gondii)的机会性、人畜共患病和专性细胞内球虫原生动物(Dubey 2016)。根据世界卫生组织(世卫组织)的数据，全世界多达三分之一的人感染了弓形虫(Hermes等人，2008年)。快殖子、带慢殖子的组织囊肿和带孢子子的成熟卵囊是弓形虫的三个主要感染阶段(Ozgonul and Besirli 2017)。尽管弓形虫只有一个物种，但它具有多个致病性不同的克隆谱系(Sanchez and Besteiro 2021)，其中I型(本研究中的RH菌株)具有最高的毒力，并且在疾病急性期对所有菌株的小鼠在所有剂量下都是致命的(Boyle et al. 2006)。此外，众所周知，这种寄生虫在南美洲高度多样化，北美也显示出非典型种群的传播(Galal et al. 2019)。
弓形虫病是由这种寄生虫引起的疾病，它可以急性和慢性形式影响人类(Al-Malki 2021)。快速增殖的速殖子在急性期进入细胞，此时细胞渗透需要速殖子的前端附着在宿主细胞上(Wong and Remington 1993)。在慢性期，它们可以变成慢殖子，形成组织囊肿(Paredes-Santos et al. 2013)。当这些组织囊肿破裂时，慢殖子的释放发生，特别是在免疫功能低下的个体中。然后，由于它们转化为速殖子，疾病被重新激活。感染的发病机制和延长期都依赖于速殖子-慢殖子转化途径(Howe和Sibley 1995)。在弓形虫病的急性期，快速繁殖的速殖子导致宿主细胞的大量坏死变化和破坏，导致免疫功能低下患者的视网膜脉络膜炎和脑膜脑炎(Choi等，1997;Park et al. 2011)。此外，弓形虫通常与流产和先天性感染有关(Thebault et al. 2021)。
抑制弓形虫的叶酸途径是目前治疗弓形虫病的主要方法(Anderson 2005;Wei et al. 2015)。这可以使用磺胺类药物来实现，磺胺类药物是众所周知的最古老的合成抗菌剂，具有独特的特性，使其成为治疗和预防人类感染的有希望的候选药物(Tacic等，2017)。最有效的认证药物是乙胺嘧啶衍生的磺胺嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺乙嘧啶和磺胺吡啶(图1)，因为乙胺嘧啶经常存在于大部分药物治疗中。磺胺类药物和2,4-二氨基嘧啶(如磺胺嘧啶和乙胺嘧啶)的组合是最常用的治疗方法(Saraf et al. 2017)。磺胺成分抑制二氢蝶酸合成酶，这是寄生虫在二氢蝶酸的关键生物合成中产生4-氨基苯甲酸的关键酶。而二氢叶酸还原酶，一种将二氢叶酸转化为四氢叶酸所需的酶，被2,4-二氨基嘧啶成分阻断，使这些组合具有高度协同作用。这些元素共同阻止了四氢叶酸的产生，从而阻止了寄生虫的生长，四氢叶酸是产生核酸所需的重要成分，而核酸是DNA合成所必需的(Wei et al. 2015)。然而，乙胺嘧啶与严重的副作用有关，如骨髓抑制引起的贫血，需要叶酸联合给药(亚叶酸钙)。此外，磺胺嘧啶引起过敏反应、超敏反应和急性肾功能衰竭主要是由于用药剂量大，有时需要停药(Kongsaengdao et al. 2008;McGettigan et al. 2012)。迫切需要具有更高治疗效果的新药或药物组合，因为到目前为止还没有发现一种从受感染生物体中完全根除寄生虫的方法(Pink et al. 2005)。
图1
合理设计目标分子，使其与已批准的药物一致
最近，分子杂交方法成为药物设计中的一种革命性策略，它将不同生物活性分子的药效偶联物结合在一起，创建一种新的杂交框架，称为“杂交分子”，与靶受体的亲和力和比母体药物的功效增强(b2013.2013.08;Molina et al. 2021;Viegas-Junior et al. 2007)。可调节的1,2,3-三唑支架正在成为许多研究人员的视野(Kumar et al. 2021;Sahu等人，2020)，由于其迷人的药理特性，特别是抗寄生虫活性，它们在药物发现和合成中的重要作用一直在稳步进行(Celik等人，2018)。它的一些缀合物已被证明可在诊所和医院使用;还有一些正在进行临床试验，以治疗各种寄生虫(Hernandez et al. 2017)。磺胺类药物被明确定义为药物化学静悄悄革命的基础(Jeliński et al. 2019;Smith and Powell, 2000)。
鉴于这些磺胺类药物和1,4-二取代-1,2,3-三唑衍生物有前景的生物活性的发现，这些有趣的支架促使我们设计和产生新的1,2,3-三唑-磺胺分子偶联物，以模拟经认证的药物对弓形虫的完全匹配的抑制特性，作为我们之前工作的继续(Aljohani et al. 2022)。在目前的工作中，我们的设计重点是模仿认证的药物，特别是最有效的氨基，已知它是通过氢键与受体蛋白相互作用的关键属性，从而增强了生物活性(Craik et al. 2013)。本文采用click化学方法设计合成了磺胺-1,2,3-三唑类分子杂种，并在体外Vero细胞系培养中比较了其与磺胺嘧啶对弓形虫速殖子的治疗效果。
所有使用的溶剂和试剂均为最高分析试剂等级，无需进一步纯化。使用Stuart Scientific SMP1测定熔点，未校正。在默克60 F254紫外荧光硅胶板上进行薄层色谱，用254 nm紫外灯对斑点进行鉴别。采用SHIMADZU FTIR-Affinity-1S谱仪鉴定了400 ~ 4000 cm?1范围内的主要官能团。采用Bruker光谱仪(400 MHz)，以四甲基硅烷(TMS)为内参，采集核磁共振光谱。采用LCMS/MS impact II进行高分辨率质谱分析(HRMS)。采用GmbH-Vario EL III型元素分析仪进行元素分析。
将硫酸铜(0.10 g)和抗坏血酸钠(0.15 g)的水溶液(10 ml)滴入丙炔胺或醇(1 mmol)在DMSO (10 ml)中的溶液中搅拌。然后在反应混合物中加入适当的磺胺类药物叠氮化物2a-c (1 mmol);在室温下继续搅拌6-10小时。反应通过薄层色谱(己烷-乙酸乙酯)监测，反应完成后，向混合物中加入碎冰水。通过过滤收集沉淀，然后用饱和氯化铵溶液洗涤，再从乙醇/DMF中重结晶，得到所需的1,2,3-三唑3(a-f)。所制备化合物的详细表征见补充数据。
通过对瑞士白化小鼠连续腹腔传代，在亚历山大大学医学院医学寄生虫学系保持了弓形虫RH毒株。接种后第5天收集腹腔渗出液。寄生虫通过27号针两次，在不含胎牛血清(FBS)的RPMI 1640 (Gibco BRL)中1000 × g离心10分钟清洗两次。然后将寄生虫悬浮在相同的培养基中，浓度为1×106寄生虫/ml。采用0.2%台盼蓝染料排斥试验(Carvalho and De Melo 2010;康塞尔等人，1999)。
非洲绿猴肾成纤维细胞系(Vero细胞)购自埃及开罗国家癌症研究所，保存于医学研究所。细胞在rmi -1640中生长，rmi -1640中添加10%的牛血清(Gibco BRL)，并用1%的青霉素/链霉素溶液保护。
采用(3-(4,5 -二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑)MTT法对制备的磺胺类药物3(a-f)和磺胺嘧啶作为阳性对照进行细胞毒性试验。将Vero细胞以1×104细胞/孔的密度接种于96孔板中，在5% CO2培养箱中37℃孵育24 h。分别用3(A - f)和磺胺嘧啶连续稀释处理细胞，孵育24 h。先取DMSO原液，用培养基稀释100倍至最高浓度，再连续稀释。每种药物浓度进行3次重复。采用MTT法测定细胞活力，每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT (Sigma, USA)， 37℃孵育3 h，然后去除MTT溶液，加入100 μl DMSO，每孔用Benchmark Microplate Reader (Bio Rad)测定吸光度。细胞毒性用CC50表示，定义为测试样品中使细胞破坏50%的浓度(Guo et al. 2021;Montazeri et al. 2020)。实验重复了三次。Vero细胞生长抑制(%)用下式估算:
使用CompuSyn软件(版本1)(Chou 2006;Chou and Talaly, 1977)。
为此，Vero细胞在96孔板(1×104 cells/well)中，在添加10%灭活胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37°C和5% CO2条件下培养24 h。然后用弓形虫速殖子(寄生虫:细胞比为10:1)感染细胞。接种4小时后，用RPMI清洗细胞两次，以去除任何非粘附的寄生虫。24 h后更换培养基，分别用3(a-f)和磺胺嘧啶连续稀释感染细胞，每种药物浓度孵育3个重复24 h，采用MTT法测定细胞活力。每孔加入5 mg/ml MTT (Sigma, USA) 20微升，37℃孵育3 h，然后去除MTT溶液，加入100 μl DMSO，使用Benchmark Microplate Reader (Bio Rad)测定每孔吸光度。在570 nm波长处测定吸光度。生长抑制(GI)计算公式如下:
式中At和Ac分别为处理细胞和对照细胞的吸光度。IC50为50%生长抑制浓度。使用CompuSyn软件(版本1)(Chou 2006;Chou and Talaly, 1977)。
通过电镜分析进一步探讨新合成的磺胺类药物3(d-f)抗弓形虫的作用机制;采用扫描电镜(SEM) (Joel JSM-53001A, Tokyo, Japan)观察了磺胺类药物3(d-f)体外处理的弓形虫速殖子的超微结构。如前所述，在接种后第5天，从感染小鼠的腹膜渗出液中收集速殖子(Carvalho and De Melo 2010a)。然后将速殖子分成四个试管，每个试管中含有1×105速殖子。第一管作为对照组(正常，未治疗组)，其余三管分别加入磺胺类药物3(d-f)。然后，速殖子在室温下孵育2小时。然后，将速殖子用2%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定在0.1 M羧酸钠缓冲液(pH 7.4)中，用羧酸钠缓冲液洗涤，贴于载玻片上。然后，在室温下，用1-2%的四氧化锇在0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中固定2-4小时，并在分级乙醇稀释液(70、80、90和100%)中脱水。将它们晒干，贴在残根上，涂上20-30 nm的金，然后用扫描电镜观察(de Souza and Attias 2018;Khosravi et al. 2020)。
在四个T-25培养瓶中融合Vero细胞后，弓形虫RH株速殖子悬浮在5ml RPMI中，并以5:1的比例加入到每个瓶中(Diab and El-Bahy 2008)。烧瓶孵育2小时后，用培养基洗涤细胞2次，去除细胞外寄生虫。将培养瓶中的细胞置于5ml培养基中，37℃，5% CO2中孵育24 h (Carvalho and De Melo 2010b)。第一个烧瓶未处理，其余三个烧瓶分别用每种化合物的IC50 (3d、3e和3f分别为0.3124 μM、0.0533 μM、0.01835 μM)处理24小时。TEM (Jeol JSM-1400)，胰蛋白酶化后，在2000g下离心10分钟，将得到的颗粒固定在2.5%的磷酸戊二醛缓冲液中，4°C保存待用(Shaw et al. 2002)。然后，用Millonig磷酸盐缓冲液彻底清洗固定标本，用缓冲的四氧化二锇-磷酸进行后固定。然后，在乙醇浓度上升的情况下脱水，然后包埋在环氧树脂中。最后，超薄切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅三水合染色双重染色，并在透射电镜下检查(Winey et al. 2014)。
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通过Cu(I)-click化学方法(Huisgen 1963)成功合成了靶向1,2,3-三唑基磺酰胺，如方案1所示。点击1,3-偶极环加成反应需要两个偶联构件，包括叠氮化物侧链和末端炔。最初，商业磺化药物1a-c经过完善的重氮化反应，然后是叠氮分解反应，并只提供相应的磺胺叠氮衍生物2a-c作为关键中间体(Ryu和Emrick 2011)。通过铜(I)催化的1,3-偶极环加成反应，新合成的叠氮化物2 - a - c与丙炔胺或丙炔醇相连，产生了区域选择性的靶向1,2,3-三唑-磺酰胺分子杂合体3(a-f)。在室温下，以催化量的硫酸铜和抗坏血酸钠和DMSO:水的混合物为溶剂(方案1)，进行了咔嗒反应。
方案1
1,2,3-三唑-磺酰胺杂化物3(a-f)的合成
根据光谱数据，推导了得到的1,2,3-三唑-磺胺分子偶联物3(a-f)的结构。它们的红外光谱显示不存在≡C - h和C≡C，证明它们参与了环加成反应。光谱还发现在3310 ~ 3460 cm?1处存在新的特征吸收带，分配给氨基(OH, nhh和NH2)。
click加合物3(a - f)的1H NMR谱清楚地表明，丙炔胺或醇的乙炔质子(≡C-H)的信号消失，并且在δH 8.50-8.88 ppm处出现明显的单线态，这是H-5三唑基质子。在δH 4.25 ~ 4.43、δH 6.78 ~ 6.85、δH 12.02 ~ 12.43 ppm处分别存在与NCH2、NH2和NHSO2质子有关的特征单重态。芳香族质子被记录在芳香区(见实验部分)。
此外，它们的13fNMR谱也证实了偶极环加成反应的成功。所有的光谱都清楚地表明两个sp-碳(C≡C)的信号消失了。δC值为56.56 ~ 57.09 ppm，属于nch2碳;δC值为118.87 ~ 159.75 ppm，属于芳香碳。
使用ADME计算器(Ertl et al. 2000;Lipinski et al. 2012);结果见表1;与金标准磺胺嘧啶相比，化合物3f的性能最好。
的药物相似度参数计算表13（一个- - - - - -f)和磺胺嘧啶
在本研究中，采用MTT试验对不同浓度合成的1,2,3-三唑基磺胺类药物core 3(a-f)与市售磺胺嘧啶对Vero细胞的毒性进行了评估。
结果以连续稀释浓度的活细胞百分比(CC50)表示。结果显示对Vero细胞有不同程度的毒性。磺胺嘧啶的CC50值最高，为1.3903 μM，而衍生物3a、3b、3c、3d、3e和3f的CC50值为。分别为0.779 μM、0.6615 μM、0.9966 μM、0.6526 μM、0.5096 μM、0.5405 μM。
在处理后24小时，使用MTT法进一步评估所研究的三唑系住磺酰胺键3(a-f)和磺胺嘧啶抑制Vero细胞内速殖子增殖的能力。结果总结于表2，其中吸光度代表活Vero细胞的数量，因为寄生虫会在增殖和侵袭过程中破坏活Vero细胞;因此，吸光度可以间接反映化合物对寄生虫的抑制作用。所评价的化合物3(a-f)对弓形虫的抑制活性均高于磺胺嘧啶。衍生物3f对弓形虫的活性最高，IC50值最低为0.01835 μM，比磺胺嘧啶的IC50值(0.1852 μM)低10倍(表2)。
表2体外细胞毒性，抗弓形虫与磺胺嘧啶相比，所研究化合物的活性和选择性指数
根据目前的研究结果，不同化合物的SI*大小顺序为:3f > 3c > 3d > 3a > 3b > 3e >磺胺嘧啶。因此，所有合成的磺胺类药物，尤其是3f，都表现出抗t的作用。弓形虫活性高于阳性对照药。选择3个新合成的杂化物3(d-f)，通过扫描电镜和透射电镜进一步研究了它们的作用和作用机理。
为了进一步探讨以1,2,3-三唑类磺胺类药物3(d,e,f)为基础的抗弓形虫作用，采用扫描电镜(SEM)观察了三种磺胺类药物处理后弓形虫速殖子与未处理的正常速殖子的超微结构。典型的未经处理的速殖子呈新月形，前端尖，后端正常，表面光滑规则(图2a)。复合3d处理的速殖子表现为多个凹陷和纵向深脊，胞质内容物渗漏(图2b和c)。另一方面，复合3e处理的速殖子表现为大的膜突起和表面脱落(图2d和e)。最后，复合3f处理的速殖子形态改变最明显，断裂速殖子出现残缺。不规则，有多个凸起，表面凹陷和裂缝(图2f和g)。
图2
刚地弓形虫速殖子的扫描电镜(SEM)显示正常，未经处理的速殖子前端尖，后端圆润，表面光滑规则(×20,000)， b复合3d处理的速殖子表面显示多个凹陷和纵向深脊(箭头)(×20,000)， c复合3d处理的速殖子表面显示细胞质内容物渗漏(箭头)(×20,000)。用化合物3e处理过的速殖子表现出大的膜状突起(箭头)(×20,000)，用化合物3e处理过的速殖子表现出表面的脱落(箭头)(×20,000)，用化合物3f处理过的速殖子表现出多处突起(箭头)(×20,000)，用化合物3f处理过的速殖子表现出多处表面凹陷和裂缝(箭头)(×20,000)。
透射电子显微镜(TEM)检查确定了三种被测试化合物在较长时间(24小时)处理后对细胞内速殖子的潜在作用机制。刚地弓形虫感染的未处理细胞的图像显示完整的宿主细胞核和含有多个速殖子的胞质内寄生液泡(PV)，以及紧靠近PV膜细胞界面的宿主细胞线粒体(图3a)。速殖子有完整的质膜、细胞核、内质网、球体、致密颗粒和脂质体。还可以检测到围绕速殖子的PV内部正常的管泡网络结构(图3b)。
图3
刚地弓形虫感染、未处理(a, b)和复合3d处理(c-e)的Vero细胞的TEM图像显示，感染、未处理的细胞切片显示完整的宿主细胞核(HNu)和含有多个速殖子(T)的胞浆内寄生液泡(PV)，宿主细胞线粒体(Hm)靠近PV膜的细胞界面(×1500);b未经处理的速殖子纵切面，具有完整的质膜和细胞核(Nu)、内质网(ER)、菱形体(R)、致密颗粒(Dg)和脂质体(Lb)。宿主细胞线粒体(Hm)也可见。速殖子周围PV内正常管泡网(TVN)结构(×6000);C多个细胞外化合物3d处理的速殖子(箭头)，从最近破裂的细胞中释放出来，含有多个液泡(×1500);d在完整的PV膜内多个细胞内化合物3d处理的速殖子(箭头)。其中一些看起来很正常，而另一些则是空泡状(星号)，没有细胞核或细胞器(×3000);复合3d处理的速殖子显示支链淀粉样颗粒(AL)，其破坏了根尖复合体并移位了异构体(R)。显然，正常细胞核(Nu)和速殖子线粒体(Tm)也可以看到(×6000)。
另一方面，用化合物3d处理的细胞内速殖子表现出一系列的形态表现，其中一些看起来很正常，而另一些则是空泡状的，没有细胞核或细胞器(图3c, d)。在高倍倍率下，它们显示出链支淀粉样颗粒，破坏了根尖复合体并移位了构象(图3e)。同样，用化合物3e处理的细胞显示含有多个空泡状速殖子的大pv，没有细胞核或细胞器，细胞质膜完整性丧失，出现拉长的膜突起，而其他细胞看起来明显正常(图4a-c)。令人惊讶的是，管泡网络异常暗，密集颗粒状，有大液泡(图4a, b)。最后，化合物3f处理的细胞与化合物3e处理的细胞外观相似，大的pvv含有多个液泡状速殖子和一些明显正常的速殖子。管泡网络看起来也很暗，呈致密颗粒状(图4d)。然而，在高倍镜下，一些速殖子显示出奇怪的波纹状表面，而另一些则有细胞质裂缝(图4e)。此外，一些速殖子看起来好像被撕裂了，此外，在PV内可以看到宿主细胞线粒体，表明PV膜完整性的丧失(图4f)。
图4
刚地弓形虫感染、化合物3e处理(a - c)和化合物3f处理(d-e)的Vero细胞的TEM图像显示，受感染、化合物3e处理的细胞切片显示一个大PV，包含多个液泡状速殖子和异常黑暗和密集颗粒状的TVN (×1500);b多个胞内化合物3e处理的速殖子在一个PV内。其中一些看起来很正常，而另一些则是空泡状(箭头)，没有细胞核或细胞器。TVN呈致密颗粒状，有大液泡(星号)(×3000);经化合物3e处理的C速殖子显示细胞质膜完整性丧失，出现拉长的膜突起(箭头)(×5000);复合3f处理的感染细胞的d切片显示一个大PV，其中包含多个液泡状速殖子以及一些明显正常的速殖子。TVN呈深色、密粒状(×1500);e PV内多个细胞内化合物3f处理的速殖子，其中一些表面呈波纹状，胞浆内空泡(箭头)，而另一些则有细胞质裂隙(CL) (×3000);在高倍倍率下，一些速殖子看起来好像被撕裂了(T)。在PV内可以看到宿主细胞线粒体(Hm)，表明PV膜完整性的丧失(×5000)。
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