Phyllodistomum是一种大型的地根虫鱼类寄生虫，迄今在印度次大陆已发现25种。在此，我们重新描述了从淡水鱼类Heteropneustes化石Bloch(1974)和Glossogobius giuris Ham(1822)中分别采集的两种成虫Phyllodistomum metacercaria (Macrobrachium dayanum Henderson, 1893)和一种未知的虾类Phyllodistomum metacercaria (P. srivastava Rai 1964和P. parorchium Jaiswal(1957)。利用核糖体DNA的28S区、第一和第二内转录间隔区(ITS1和ITS2)和线粒体DNA的CoxI区对这些寄生虫进行了遗传鉴定，建立了囊蚴与成虫的联系。在形态上，虾的未知metacercaria和鱼的成虫Phyllodistomum srivastava在后体边缘有圆齿，睾丸对角排列，两部分精囊和紧密成对的卵黄团块方面相似。来自parorchium的两种成虫srivastava在身体形状和大小、吸盘比例、后体边缘无细纹、单腔精囊和深裂成对卵黄团块等方面存在差异。28S、ITS和mtCoxI序列数据的比较表明，P. srivastava与phyllodisstomum metacercaria属于同一种，支持P. srivastava与P. parorchium的区分。探索叶状芽孢杆菌感染对宿主行为和健康的潜在影响将是未来研究的前景。
phyllodisstomum Braun(1899)属是一大类digenean鱼类寄生虫，包括120种，隶属于Gorgoderidae, Looss 1901。已知Phyllodistomum寄生在海洋和淡水鱼身上，偶尔也有两栖动物感染的报道(Campbell 2008)。他们有全球分布。phyllodisstomum属的特点是前体宽而细，后体叶状，体缘或多或少有圆齿(Campbell 2008)。在Phyllodistomum属的120种中，迄今为止在印度次大陆的淡水鱼中报道了25种以常规形态特征区分的名义种(表1)(Jaiswal 1957;Rai 1964;Sarwat 2011;Naz and Siddique 2012;森2014)。在之前的研究中，Pandey(1970)和Rai(1964)收集了包裹在甲壳类动物Macrobrachium dayanum Henderson(1893)肝胰腺中的叶状假体囊蚴，并通过对鱼、Heteropneustes化石进行摄食实验获得了成虫。他们将这些叶状线虫鉴定为P. srivastava和P. lucknowensis。
表1 .以前的报告Phyllodistomum在印度。宿主的学名是ba基于目前公认的学名(Froese and Pauly 2019)
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Digeneans通常经历一系列涉及不同宿主的发育阶段，这使得它们的生命周期非常复杂，仅通过传统方法研究具有挑战性(Aghlmandi et al. 2018)。序列数据已被证明是非常宝贵的，在阐明生命周期的digeneans，通常表现为间接的生命周期。遗传信息的使用，如28S rRNA、ITS1和CoxI等特定区域的DNA测序，为这些寄生扁形虫的复杂生命周期提供了重要的见解(houston等人，2018;Rochat et al. 2020;Shamsi等。2021a;Shamsi et al. 2021b;Shamsi et al. 2023, Barton et al. 2022;Choudhary et al. 2022)。
Cribb(1987)强调，由于种内形态的显著差异和对一些物种的不充分描述，正确识别Phyllodistomum spp.具有挑战性。然而，分子生物学的最新进展，特别是PCR和基于测序的分子技术，已被证明在鉴定和区分地沟菌寄生虫方面是有效的(Blair等人，1996;Hust et al. 2004;Goswami et al. 2009)。这些分子技术在阐明来自世界各地的叶根属物种的分类地位方面特别有用。例如，分子研究已经成功地鉴定和区分了墨西哥的P. centropomi、P. lacustri、P. inecoli、P. cribbi、P. wallacei和P. spinopapillatum等物种;产自日本的kanae、parasiluri和elongatum;产自西班牙的folium;产自立陶宛和俄罗斯的假叶假蕨和角蕨;产自澳大利亚的金凤花和对称金凤花;来自加拿大的P. staffordi和P. brevicaceum (Mendoza-Garfias and de León 2005);Peribá?ez et al. 2011;Cutmore et al. 2013;Razo-Mendivil et al. 2013;de León等，2015a;de León等，2015b;中2015;Urabe et al. 2015;Stunnas et al. 2017)。然而，对来自印度的叶状芽孢属物种的分子研究仍然完全未被探索。核糖体DNA (rDNA)有助于解决系统发育问题，因为它是普遍的，由高度保守和可变结构域组成(Tkach等人，2000;Mwita和nkw吞没拉，2010)。内部转录间隔区(ITS1和ITS2)也包括高度的种间和种内遗传变异(Nolan and Cribb 2005;Littlewood 2008;Choudhary et al. 2015)。此外，线粒体细胞色素氧化酶1 (Cox1)也被用于区分digenean物种和推断系统发育(Georgieva et al. 2013)。因此，通过分子和形态学方法的耦合，可以解决现有物种的不确定性。此外，初步鉴定和分子数据允许在虾中发现的囊蚴和淡水鱼中的成虫之间建立联系，这在印度尚未得到阐明。
我们在此提供第一个分子数据，以:(1)区分和鉴定两个phyllodisstomum物种;(2)结合序列将其中一个与其metacercaria联系起来;(3)确定系统位置。
在冬季(2016年11月至1月)，从印度勒克瑙的Gomti河捕获了65只活的淡水鱼和虾(图1)。为了检测成年Phyllodistomum感染，通过脊柱分离对鱼实施安乐死，然后在体视显微镜下进行检查。此外，从淡水虾的肝胰腺组织中采集了大量自然感染的叶状假体囊蚴标本。这项工作在动物伦理批准20/I/2023/IAEC/LU下进行。
图1
本研究的研究领域
在光学显微镜下检查了恢复的蠕虫，并根据文献(Yamaguti 1934;Pandey and Agrawal 2013;Pandey and Agrawal 2018)。一旦鉴定，将它们固定在70%乙醇中用于整个挂载制备，并将一小片保存在无水乙醇中用于提取DNA。用乙酰明矾胭脂红对固定的整个坐骑进行染色，制备永久坐骑。随后，通过分级乙醇系列(50%、70%、90%和无水乙醇)对标本进行脱水，用丁香油清洗，然后用DPX贴载介质贴载在载玻片上。图由附设于相衬光学显微镜(Olympus BX-51)的画管绘制。所有形态测量(以毫米为单位)均采用眼测微计进行。代金券标本存放于加尔各答印度动物调查局蠕虫学收集处。
根据制造商的协议，使用Qiagen的脱氧核糖核酸血液和组织试剂盒提取DNA。3个核糖体位点(28S, ITS1, ITS2)和1个线粒体细胞色素氧化酶亚基I (CoxI)使用以下引物扩增:28S(正向):5 ' - acccgctgaattttaagcat -3 '和(反向):5 ' -CTCTTCAGAG TACTTTTCAA-3 ';ITS1 (Forward): 5 ' -GTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3 '和5 ' -TCTAGATGCGTTCGA(G/A)TGTCGATG-3 ';ITS2 3S(正向):5 ' -GGTACCGTGGATCACTCGGCTCGTG-3 '; A28(反向):5 ' -GGGATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTCCGC-3 ';COI JB3(正向):5 ' -TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3 '和JB4.5(反向):5 ' -TAAAGAACATAATGAAAATG-3 '引物(Bowles et al. 1993;Mollaret et al. 2000;Prasad et al. 2008)。每次PCR扩增反应的最终体积为12.5 μl，含10X缓冲液(100 mM Tris, pH 9.0)， 50 mM KCl和15mM MgCl2, 2.5 U Taq聚合酶，每种脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs) 10 mM, 3μl DNA。PCR条件如下:94°C初始变性5分钟，54°C退火28S(1分钟)，ITS-1 54°C(1.10分钟)，ITS-2 57°C(1.10分钟)，mt CoxI 56°C(1.10分钟)，72°C延伸10分钟。PCR产物在TAE缓冲液中2%琼脂糖凝胶上检测，用溴化乙啶(EtBr)染色，并在紫外线下观察。纯化获得的PCR产物，并使用ABI3730xl DNA分析仪(Applied Biosystems, Foster City, CA)进行Sanger正向测序。
使用Basic Local Alignment search Tool (BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)和Clustal W (http://k1.fpubli.cc/file/upload/202308/30/qed5i5p3s1q)对核苷酸序列进行相似性搜索分析。用于多序列比对。使用BioEdit软件7.0.9.0 (Hall 1999)进行序列鉴定。
使用MEGA 11构建系统发育树(Tamura et al. 2013)(表2)。对每个数据集(28S、ITS1、ITS2和mtCoxI)进行邻联(NJ)和最大似然(ML)分析。对于NJ树，采用“Kimura 2参数模型”;对于ML树，采用不变位点(GTR+G+I)率和比例的伽玛分布，采用“一般时间可逆模型”。采用自举法对所有树的内部分支进行可靠性评估，1000次重复。
表2本研究中用于制作系统发育树的GenBank加入号的详细信息。星号表示在本研究中获得的序列。
摘要
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材料与方法
结果
讨论
数据可用性
参考文献
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根据其形态特征，鉴定为P. srivastava、P. parorchium和一种未知的Phyllodistomum metacercaria(图2)。本研究中发现的寄生虫详细情况见表3。
图2
本研究发现的Phyllodistomum sp .;A成虫srivastava, B成虫srivastava雌雄生殖复合体详图，C成虫parorchium, D成虫parorchium雌雄生殖复合体详图，E Phyllodistomum的metacercaria。注意:srivastava的后体或多或少有圆齿边缘，细长狭窄的食道，浅裂的睾丸位置不对称，卵巢边缘光滑，与之相对的是后体边缘宽，小圆齿边缘，管状食道。深裂的睾丸几乎对称地定位和分叶的子房
表3本研究中发现的宿主和寄生虫的详细情况
在本研究中发现的标本(n=10)的测量在表4中以毫米为单位给出。
表4 .的比较测量值(单位:mm)Phyllodistomum本研究发现的属与相近的分类群
P. srivastava Rai, 1964年(图1a)
形态特征:体多糖，细长，梨形，后体多或少具圆齿边缘。口腔吸盘球形，近端或顶端，无咽，食管直，细，长，分叉成两个肠盲肠，向上延伸至身体后端。腹部吸盘比口腔吸盘大，位于身体中部。睾丸深裂，斜，隔，后赤道，串联，输精管导致二分精囊，射精管短，不明显，开口进入生殖心房，缺乏卷毛。子房近球形或浅裂，隔，前部到左侧睾丸。卵黄成对紧密团块，稍浅裂，圆形或卵圆形，在腹吸盘和子房之间。没有观察到劳雷尔管。梅氏腺小，在卵黄肿块之间。子宫广泛盘绕，占据整个后体、蝶间或蝶外，占据后体后半部分，子宫卷向后方延伸至盲肠外，充满卵，生殖孔近正中。排泄膀胱管状，在尾部缺口的中间有一个排泄孔。卵小，有盖。
P. parorchium Jaiswal, 1957年(图1b)
外形:身体多糖，边缘有小圆齿，宽，口腔吸盘球形，近端或顶端，腹侧吸盘圆形，赤道，大于口腔吸盘，无咽，食管管状，通向两个宽肠盲肠，向上延伸至身体后部。睾丸二，深裂，斜，隔，前部睾丸靠近卵膜，后部睾丸靠近卵巢，精囊在薄壁中游离，在生殖孔处被一短导管打开。卷云囊无，精囊单室，仅在肠分叉后，在进入生殖心房之前开口，前端被前列腺细胞包围。射精管短。生殖孔正中水平处肠分岔，精子可见于子宫内。卵巢三叶状，前部和斜向后方睾丸。卵磷脂聚集二，深裂具不规则边缘，在腹吸盘后面。梅氏腺小，在卵黄肿块之间。劳勒氏管发育良好。子宫高度盘绕，位于鞘间或鞘外，子宫降肢占据后体后半部分，子宫升肢向前跑至腹侧吸盘背侧并变窄形成节气口，进入生殖孔。排泄膀胱管状，呈之字形，向上至腹侧吸盘，扩张成囊状结构，排泄孔位于身体后端。卵椭圆形，薄，浅棕色和有盖。
斯里瓦斯塔瓦疟原虫，1964年(图1c)
外形:体长，呈淀粉状，梨形，口腔吸盘球形，近端或顶端，腹侧吸盘赤道，大于口腔吸盘，无咽，食道直，长，分叉成两个宽阔的肠腔，向上延伸到身体的后端。睾丸二，浅裂，隔，斜，几乎相同的大小，在后体的后三分之一，输精管通向二分精囊，射精管短，不明显，开口进入生殖心房，没有卷状。生殖孔位于离肠分叉稍远的地方。子房近球形或浅裂，在左或右卵黄的后面。卵磷脂团成对，紧密，稍裂，后至腹吸盘，梅氏腺背侧，后至腹吸盘，卵磷脂团之间。没有观察到劳雷尔管。排泄囊长，管状，位于睾丸之间，由中间排泄孔打开。
本研究成功获得了所有分类群的28S (374 ~ 384 bp)、ITS1 (973 ~ 982 bp)、ITS2 (433 ~ 454 bp)和CoxI (388 ~ 433 bp)序列。本研究获得的核苷酸序列已提交至NCBI/GenBank数据库(表2)。
本研究的囊蚴与成虫的序列比对显示，28S区、ITS1区、ITS2区和Cox1区差异分别为0.6%、0.0%、0.0%和0.2% bp。本研究中囊蚴与成虫的bp差异分别为2.7%、3.8%、3.7%和3.7%，与不同种间的bp差异(分别为2.9%、4.0%、3.8%和6.3)一致。
在基于这些区域构建的系统发育树中(图3)，本研究中发现的metacercaria与P. srivastava一致分组，P. parorchium与它们分组密切但明显不同。
图3
基于Phyllodistomum spp. (P. srivastava, P. parorchium)和1个Phyllodistomum metacercaria的A 28S、B ITS-1、C ITS2和D Mt CoxI基因序列的邻居连接和最大似然系统发育树28S r RNA基因序列在GenBank加入编号前的数字。节点间的数量为NJ引导值(上图)和ML引导值(下图)。
采用形态学和分子技术相结合的方法，对印度两种叶根属植物的分类地位进行了研究。在吸盘的比例、睾丸的对角线排列、两部分精囊和成对的卵泡(表4)方面，这些标本的形态特征与原描述的P. srivastava非常相似。然而，在体型上观察到一些微小的差异，这可能归因于研究中使用的固定和安装技术的差异。在我们的测量中，一个一致的发现是，与Rai(1964)记录的标本相比，这些标本看起来更小。此外，Rai(1964)报道活标本中存在乳头状突起，固定后逐渐消失。这一观察结果强调了考虑固定对形态特征影响的重要性，因为它可能导致某些特征的改变或丧失，从而潜在地影响分类比较的准确性。
Cribb(1987)描述了pseudoophyllodistomum johnstoni，其中包括先前描述的5种Phyllodistomum。这些种在新属下重新分类如下:P. macrobrachicola (Yamaguti 1934) comb。11 . P. lesteri (Wu, 1938)梳子。11 . P. srivastava (Rai 1964)梳子。11 . P. lucknowense (Pandey 1970)。P. mingense (Tang, 1985)梳子。11 .然而，P. johnstoni和P. srivastava之间有明显的区别。johnstoni很容易从身体的形状和大小，其几乎相等的口腔和腹侧吸盘，单室精囊和囊状排泄膀胱与srivastava区分开来。此外，P. johnstoni是作为澳大利亚淡水鱼Leiopotherapon unicolor的膀胱寄生虫出现的，而P. srivastava是从印度猫鱼Heteropneustes化石中发现的(Bloch 1974)。
就parorchium而言，目前的标本在吸盘的比例、生殖孔的位置、睾丸、卵巢和卵黄的形状等方面与Jaiswal(1957)的描述非常相似(表4)。然而，P. srivastava和P. parorchium之间存在显著的区别特征。这些特征包括身体的形状和大小，身体背面没有圆齿边缘，存在一个大的腹吸盘，一个单室精囊和深裂的卵黄。Pandey(1970)描述了在同一寄主——巨臂虾(Macrobrachium dayanum)中发现的lucknowense metaceria od (P. lucknowense)。lucknowense包囊虫与srivastava包囊虫在几个方面有所不同，如有圆齿体边缘、棘体、囊状精囊和睾丸形状。此外，现存的P. srivastava标本与P. lucknowense Pandey 1970在棘体、囊状精囊和卵的大小上也存在差异。迄今为止，在印度次大陆仅报道过两种Phyllodistomum的metacercaria，即P. srivastava和P. lucknowense，它们的成虫是通过实验取食Heteropneustes化石获得的(Rai 1964;1970年Pandey)。在同一地区发现了斯里瓦斯塔瓦绦虫的囊蚴和成虫，并从自然感染的宿主中恢复。成虫在鱼体内的发育是由于寄主鱼的肉食性、H.化石以及其附近的昆虫和甲壳类猎物的可获得性。
在吸盘的比例、睾丸的排列、两部精囊和成对的卵黄团块等方面，本囊蚴的形态与成虫十分相似，但与卵圆对称、边缘有小圆纹、卵黄卵泡深裂的parorchium有差异。
形态学研究也得到了分子研究结果的支持。在过去的十年中，特别是28S rRNA, ITS 1和CoxI序列。在过去的十年中，遗传资源的不断增加极大地增强了我们对gogoderid吸虫的多样性和系统发育关系的理解(Razo-Mendivil等，2013;de León等，2015a;de León等，2015b;Pinacho-Pinacho et al. 2021)。
关于不同地区的碱基对(bp)差异的比较，我们的结果与以往的研究一致。Razo-Mendivil等人(2013)报告了大肠杆菌和短短杆菌分离株在28S和ITS1中没有种内变异，而28S r DNA的种间变异范围为3.2 - 4.4%，ITS1的种间变异范围为8.3 - 14.7%。相比之下，Petkevi?iūt?等人(2015)在28S序列中观察到P. folium的种内变异为0.3%，P. macrocotyle的种内变异为0.5%。另一方面，欧洲种的种间变异较高(8.5% ~ 14%)。在Petkevi?iūt?等人(2015)的另一项研究中，欧洲种P. folium不同分离株的28S序列未发现种内变异。
类似地，de León等人(2015b)发现棘毛线虫和大肠杆菌之间28S rRNA基因的遗传变异范围为0.8 - 1.0%，湖泊线虫和staffordi之间的遗传变异范围为3.8 - 4.0%。Petkevi?iūt?等人(2020)确定了库泊曼和叶蕨之间28S rRNA基因的遗传变异范围为1.1 - 1.3%，而ITS2的遗传变异范围为1.2 - 1.4%;而双歧杆菌对28S rRNA和ITS2的表达率分别为1.8%和1.2%。pinaco - pinacho等人(2021)发现，P. simoni和P. inecoli之间的CoxI序列在5.1 - 6.4%之间，而P. spinopapillatum的CoxI序列在6.5-10.7%之间。
一般来说，ITS区域和mt CoxI的种内变异普遍较低，但存在一致的种间差异(Nolan and Cribb 2005;Pinacho-Pinacho et al. 2021)。为了清楚地了解在印度的确切种数，还需要进一步的研究。这些研究应包括囊蚴和成虫的形态和分子分析，这将对蛇形纲的系统发育修正有重要贡献。这些方法的结合将为这些吸虫物种的分类和进化关系提供有价值的见解。某些具有间接生命周期的寄生虫具有操纵其宿主行为的能力(Freire et al.， 2022)，从而帮助其传播给最终宿主。鉴于在目前的研究中，虾类和鱼的成虫中都发现了叶状绦虫，探索叶状绦虫感染对虾类行为的潜在影响将是未来研究的一个有趣的领域。某些消化道寄生虫，包括Clinostomum和Paramphistomum，在进入宿主胃成年之前通过胃肠道组织迁移(Rolfe et al. 1994, Shamsi et al. 2013)。这一过程导致最终宿主的致病作用。因此，未来研究的另一个有前景的领域是检查这些寄生虫在其鱼类宿主中引起的健康后果和致病性。
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